SABC(山羊IgG)-POD說(shuō)明書(shū)

貨號(hào):SA0031

 試劑盒組成:

1，  封閉液（5%BSA）：10ml。

2，  3% H2O2：10ml。

3，  Bio-兔抗山羊IgG：濃縮液100ul。

4，  SABC-POD:濃縮液100ul。

5，  稀釋液：30ml。

6，  顯色液（1ml+1ml）:20×DAB顯色液A,20×DAB顯色液B。

試劑盒保存：如果一段時(shí)間不使用，請(qǐng)將所有試劑存放于-20℃，如經(jīng)常使用，可將封閉液，封閉液和20×DAB顯色液B存放于2-8℃以方便使用

試劑盒簡(jiǎn)介：

本試劑盒適合于一抗為山羊IgG的免疫組化實(shí)驗(yàn). DAB顯色。

SABC是專(zhuān)為免疫組化和其他免疫檢測(cè)而設(shè)計(jì)的，用以顯示組織和細(xì)胞中抗原分布。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì)，同親和素一樣，對(duì)生物素有*的親和力，親和素是一個(gè)堿性蛋白質(zhì)（IP=10），經(jīng)改造后可以轉(zhuǎn)變成中性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素等電點(diǎn)接近中性，對(duì)組織和細(xì)胞的非特異吸附很低，基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—Biotin Complex。SABC大約可形成一百個(gè)左右的過(guò)氧化物酶和五十個(gè)左右的鏈霉親和素所構(gòu)成的復(fù)合物。大量的酶將保證SABC具有很高的敏感性。

自備試劑：

1．粘片劑多聚賴(lài)氨酸。

2． 0.01 M PBS（pH7.2-7.4）

3． 0.01M檸檬酸鈉緩沖液

4、蘇木素

 實(shí)驗(yàn)步驟: 微量試劑請(qǐng)離心后使用

以石蠟切片為例

1. 切片常規(guī)脫蠟至水(三次二甲苯，三次乙醇)。

2. 3%H2O2室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。

3．可選步聚：a、熱修復(fù)抗原，將切片浸入0.01M 檸檬酸鈉緩沖液（PH6.0）,電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10分鐘后，反復(fù)1-2次。冷卻后PBS（pH7.2-7.4）洗滌1-2次。b、酶消化，滴加消化液，37℃10分鐘， PBS（pH7.2-7.6）洗滌2-3次。c、跳過(guò)此步，直接進(jìn)入下一步。

4． 滴加5%BSA封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體, 不洗。

5．用稀釋液將一抗（如山羊抗IL-10）按一定比例稀釋?zhuān)ㄏ♂尯蟮囊豢?℃可保存一周），也可另行購(gòu)買(mǎi)抗體稀釋液。滴加稀釋的一抗，37 ℃ 1小時(shí)左右或20℃時(shí)2小時(shí)左右。也可4℃過(guò)ye。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鐘×3次。（一抗的稀釋度、孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性染色強(qiáng)度不夠時(shí)，可提高一抗?jié)舛群脱娱L(zhǎng)孵育時(shí)間；背景過(guò)高時(shí)，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時(shí)間。）

6．根據(jù)使用量，用稀釋液將Bio-兔抗山羊IgG濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul Bio-羊抗山羊IgG濃縮液,混勻即成工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加Bio-羊抗山羊IgG工作液,20-37℃ 30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鐘×3次。

7．根據(jù)使用量，用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-POD濃縮液，混勻即成SABC-POD工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-POD工作液,20-37℃，30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗5分鐘×4次。

8．DAB顯色:根據(jù)用量，用PBS（pH7.2-7.4）配制，按1mlPBS加入50ul 20×DAB顯色液A，加入50ul 20×DAB顯色液B 。混勻后加至切片。室溫顯色, 鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。

9．蘇木素輕度復(fù)染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。

對(duì)于細(xì)胞片，常規(guī)固定后，PBS漂洗兩次，再用0.5%Txiton X-100室溫20分鐘，PBS漂洗兩次，3%H2O2處理15分鐘；PBS漂洗兩次，下接上面第4步。

對(duì)于冰凍切片，固定后，可用PBS漂洗兩次，再接上面第二步。

注意事項(xiàng)：如果染色背景過(guò)高，在SABC反應(yīng)之后，DAB顯色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次，然后DAB顯色。

因?yàn)槊庖呓M化指標(biāo)眾多，標(biāo)本不一，此步驟僅作參考。